如何選擇HPLC制備柱
沃特世制備柱應用選擇快速推薦表
應用類型 | 色譜柱品種 | 應用特色 |
常規反相制備 | XBridge C18：實驗室必備柱 | ●BEH 雜化顆粒技術，柱耐受性與通用性更好，pH 1-12。 ●尤其適用于對胺基類化合物選擇高pH 條件以獲得更好的保留與載量。 ●色譜選擇性與ACQUITY UPLC BEH C18 完全一致。 |
常規反相制備 | SunFire C18：實驗室必備柱 | ●高純硅膠C18，pH 2-8。載量大、分辨率高，在中-低pH 使用范圍內通用性極佳。 ●特別適用于要求高分辨、高載量的痕量組分制備。 ●對于胺基類化合物，當需要使用低pH 條件、甚至甲酸體系時，峰形佳。 |
常規反相制備 | XSelect CSH C18：實驗室必備柱 | ●CSH 雜化顆粒技術，柱耐受性與通用性極佳，pH 1-11。 ●切換氨水/ 甲酸反相體系時柱平衡迅速，特別適用于配MS 引導的制備純化系統。對胺基類化合物峰形卓越。 ●色譜選擇性與ACQUITY CSH C18 完全一致，可先用UPLC 進行pH 條件切換篩選，再放大到純化系統進行制備。 |
極性較大和/或疏水性強的化合物 | Atlantis T3 | ●高純硅膠C18，pH 2-8。有效增強對極性化合物的反相保留，三鍵鍵合C18不易流失，與100% 水相完全兼容，與MS檢測完全兼容。 ●同時對強疏水性化合物的保留減弱，有助于減少有機溶劑耗量，并提高對強保留化合物的制備回收率。 ●色譜選擇性與ACQUITY UPLC HSS T3 柱類似。 |
反相無法保留的高極性化合物 | XBridge Amide | ●BEH 雜化顆粒基質，三鍵鍵合酰胺基，耐受性與通用性極佳，pH 2-11。 ●按HILIC 原理保留高極性化合物，尤其適用于酸性化合物(如膦酸類)、中性化合物(如寡糖類或多羥基類)或混合組分樣品。 ●色譜選擇性與ACQUITY UPLC BEH Amide 完全一致。 |
反相無法保留的高極性化合物 | XBridge HILIC | ●BEH 雜化顆粒基質，無鍵合相，耐受性優于硅膠基質柱，pH 1-9。 ●按HILIC 原理保留高極性化合物，尤其適用于堿性化合物(如季銨鹽類)。 ●色譜選擇性與ACQUITY UPLC BEH HILIC 完全一致。 |
芳香類化合物或苯基柱應用 | XBridge Phenyl | ●BEH 雜化顆粒技術，柱耐受性極佳，pH 1-12。 ●苯基鍵合相對芳香類化合物有特殊的選擇作用。三鍵鍵合苯基有效增強鍵合相耐受性與柱壽命。 ●當分離目標還具有胺基或羧基官能團時，可利用不同pH 條件下的選擇性提高載量和分離度。 ●色譜選擇性與ACQUITY UPLC BEH Phenyl 柱完全一致。 |
合成肽 | PST 肽分離技術柱： XBridge BEH130 C18 XBridge BEH300 C18 | ●BEH 雜化顆粒技術，柱耐受性與通用性好(pH 1-12)，尤其適用于肽分離時常用的TFA 體系及較高溫度。 ●填料經肽混標質控，以確保批次重現性。 ●有130? 和300? 兩種孔徑可供選擇。 ●色譜選擇性與ACQUITY UPLC BEH130 C18 或BEH300 C18 完全一致。 |
合成寡核苷酸 | OST 寡核苷酸分離技術柱 | ●BEH 雜化顆粒技術，柱耐受性與通用性好(pH 1-12)，尤其適用于寡核苷酸分離純化所需的高鹽、高溫條件。 ●填料經寡核苷酸混標質控，以確保批次重現性。 ●色譜選擇性與ACQUITY UPLC OST C18 柱完全一致。 |
從分析柱到制備柱直接放大，常用計算公式：
放大倍數-用于估算上樣量：
流速放大估算：
流速可用于計算與分析柱應用時完全相當的線性流速條件下對應于更大色譜柱的體積流速。但是，合理的流速將取決于柱規格。當柱長增加、粒徑減小時，柱背壓會相應增加，會受到液相系統耐壓性的限制。
梯度持續時間估算：
制備柱上樣量預估
對于OBD制備柱的大概上樣量(毫克)，梯度洗脫模式時：
1合理流速取決于柱內徑。隨柱長增加及填料粒徑減少，柱背壓增大，使用時會受到液相設備的耐壓性的限制。在制備柱上的梯度持續時間，應按照與分析柱應用時相等的梯度洗脫體積與柱體積之比的倍數因子計算(計算公式見“梯度持續時間估算"公式)。
2此處進樣體積數值基于50 mm柱長并使用較強溶劑溶解樣品時。如增加柱長，進樣體積亦可增加，但并不成正比。使用較弱強度的溶劑溶解樣品，能顯著提高進樣體積量。
制備柱的樣品載量受制于許多因素。左邊所列數據僅為“平均狀況下"的預估值。通常規律有：
■ 強保留的目標物載量較大
■ 樣品簡單時載量較大
■ 需要高分辨時載量降低
■ 樣品載量受上樣條件影響很大：
- 受限于樣品體積
- 受限于樣品溶劑的強度
■ 對于肽樣品，其載量主要取決于目標肽序列以及肽樣品的溶解性，建議按所列值的5-20%預估*。
裝填技術與柱硬件對性能的影響
實驗室規模的HPLC分離純化對色譜工作者提出了諸多挑戰，其中一個最大的挑戰是制備色譜柱本身。由于柱與柱之間在性能和使用壽命上的不一致性，常常導致樣品損失、重復純化操作以及從小體積柱到大體積柱的放大能力差。沃特世科學家意識到這個問題的存在，歷經三年，研究了裝填工藝過程中的所有因素以及柱設計本身。在此基礎上，沃特世公司于2003年推出了專利*技術OBDTM(Optimum Bed Density，最佳柱床密度)應用于沃特世制備
柱產品。(*UK專利號 # GB2408469)。
問題的根本原因就是在于，制備柱的柱床裝填必須足夠致密，才能在使用過程中能夠承受流動相壓力而仍保持穩定的柱床狀態。傳統的勻漿裝填方法，用于分析柱規格時能夠產生必需的柱床密度；但是當用于制備柱并使用較小粒徑填充制備柱時，隨著柱內徑與長度的增加，就越來越難以達到柱長期使用仍能保持穩定耐受時所必需的柱床密度。柱床密度的優化，取決于色譜填料的特定性質與所采用的柱設計。
沃特世OBD色譜柱設計
沃特世已將高壓勻漿填充與經過仔細計算的軸向壓縮因素相結合，應對于柱頭裝填密度較小的部分。
按照制備柱OBD設計理念，并按每種填料類型和每種柱規格的立體幾何學加以精心微調的實際操作工藝，就可以獲得可預測的、對整個柱床長度都均勻一致的裝填密度。在裝填結束后的封柱過程中，沃特世柱裝填操作依從仔細嚴格的操作流程，從而確保不會以任何不均勻的方式過度壓縮或擾動柱端部分。
OBD制備柱硬件設計包括一對精心設計的分流板和化學惰性密封圈，以防止在高壓操作下出現漏液情況。
OBD制備柱裝配件圖解
